Plateforme de puces protéiques en phase reverse

La plateforme de puces protéiques en phase reverse a été créée au sein du laboratoire de Signalisation, dirigé par Thierry Dubois, dans le cadre du partenariat entre l'Institut Curie et le groupe pharmaceutique Servier. La plateforme est ouverte aux collaborations depuis octobre 2009 grâce à un financement du Cancéropôle Ile-de-France.

• La technique

La RPPA (Reverse Phase Protein Array) est une technologie innovante de puces protéiques permettant d'allier le haut débit à une faible consommation de matériel biologique. Cette technologie de dot-blot miniaturisé consiste à déposer, à l'aide d'un robot, des lysats tissulaires ou cellulaires directement sur une lame de microscope couverte de nitrocellulose. Les protéines d'intérêt sont ensuite étudiées à l'aide d'anticorps très spécifiques. Cette technologie, robuste et quantitative, permet de déposer environ 1 ng d'extrait protéique, soit 10 000 fois moins que pour un western blot, et d'analyser jusqu'à un millier d'échantillons simultanément. En utilisant des anticorps spécifiques pour des modifications protéiques, comme la phosphorylation, la RPPA permet d'étudier l'état d'activation des voies de signalisation cellulaires.

Aujourd'hui, près de 500 anticorps primaires ont été validés pour être utilisé sur cette plateforme. Cette gamme d'anticorps couvre la plupart des voies de signalisation cellulaire. De nouveaux anticorps sont validés continuellement, en fonction des projets scientifiques définis.

Pour une analyse en RPPA, nous avons besoin de seulement 25 µl à 1 mg/ml de protéines totales par échantillon. C'est pourquoi cette technologie est particulièrement intéressante pour l'analyse d'une grande série d'échantillons précieux, comme des cinétiques de traitement, des biopsies humaines, des xenogreffes, des cellules triées par cryométrie en flux, etc.

• L'équipement

Nous sommes depuis octobre 2009 équipés d'un spotteur entièrement automatisé de chez Aushon Biosystems, dans lequel 16 pointes de 185 µm de diamètre déposent un volume de environ 1,6 nl par échantillon, à partir de plaques 384 puits. Les lames utilisées sont des UniSart 3D nitro slides (Sartorius), FAST slides (Maine Manufactering) ou ONCYTE Film Slides (Grace Bio-Labs).
La révélation des lames ainsi spottées se fait de façon robotisée en utilisant un Autostainer (DAKO). La fluorescence est ensuite détectée par un scanner (GenePix 4000B et Innoscan 710-IR) et les signaux quantifiés avec le logiciel Microvigene (VigeneTech).
Pour l'analyse des données, nous collaborons avec l'équipe bioinformatique de E. Barillot (U900).

Pour plus d’informations
Leanne DE KONING, PhD
Institut Curie Département de Recherche translationnelle
Plateforme RPPA
Hôpital Saint-Louis
Quadrilatère historique, Porte 13
1, rue Claude Vellefaux
75010 Paris
Tel +33 (0)1 53 19 41 34
Leanne.De-Koning@curie.fr