Nos pôles d'expertise

Nos pôles d'expertise

Préparation d’échantillons 

La plateforme de génomique propose des services adaptés à la préparation d’échantillons ainsi qu’au contrôle de la qualité et de l’intégrité du matériel biologique extrait. 

Ce service à la carte s’adapte au type d’échantillons (congelé, fixé, liquide, …) et au type de molécules d’intérêt (ADN, ARN principalement). L’approche proposée suivra les bonnes pratiques de laboratoire et les critères de qualité établis en partenariat avec le CRB de l’institut Curie.  

En plus d’un savoir-faire sur la préparation d’acides nucléiques à partir d’échantillons disponibles en quantité limitante, voire dégradés, la plateforme à mis en place depuis 2020 la préparation d’ADN d’ultra haut poids moléculaire (>100kb).  

Si vous êtes intéressés pour nous aider à améliorer nos pratiques, contactez-nous! 

Les contrôles qualité sont mis en œuvre par la plateforme ou par les utilisateurs eux-mêmes après formation pour un usage en pleine autonomie (via la plateforme de réservation en ligne Openiris).   

Circuit pré-analytique : préparation et contrôle-qualité d'acides nucléiques

Equipements :

  • Crysotat CM3050 Leica
  • KingFisher, Thermo
  • Nanodrop ND8000, Thermo
  • Qubit 8 canaux, Thermo
  • BioAnalyzer, Agilent Technologies
  • Fragment Analyzer, Agilent Technologies
  • Femto Pulse, Agilent Technologies
  • Robot Assist Plus, Integra

Réservation

Analyses ADN

Les variations de polymorphismes et les altérations structurales des génomes sont analysées avec des méthodes spécifiques, en constante évolution. 

Les variations de séquences donnant lieu à des polymorphismes nucléotidiques (SNP) peuvent être analysées de manière ciblée par génotypage type qPCR Taqman voire par une analyse de STR par séquençage Sanger. Les analyses de génotypage à large échelle sont menées actuellement via l’usage de puces Axiom de ThermoFisher (400k-700k marqueurs). Des analyses plus exhaustives peuvent être envisagées, n’hésitez à nous contacter pour mettre en place de nouveaux outils.

Les variations de séquences dues à des insertion, délétions, translocations, répétitions, des gains ou des pertes de régions génomiques, des aneuploïdies, peuvent être caractérisées grâce aux techniques de puces SNP et de peignage moléculaire à haut débit telle que proposée par la cartographie optique développée par Bionano. L’approche de cartographie optique peut faire l’objet de développement spécifique pour marquer des régions d’intérêt dans un canal de fluorescence supplémentaire. Si la caractérisation de variants structuraux du génome nécessite des outils complémentaires en particulier du fait de la complexité des anomalies du génome étudié, nous proposons des méthodes de séquençage ciblé via les outils d’Oxford Nanopore Technologies (gRNA/cas9 targeted sequencing, adaptive sequencing).

Selon les besoins des équipes, la plateforme peut préparer des librairies pour le séquençage ciblé ou non.

Enfin des analyses primaires de données peuvent être menées par l’équipe génomique, selon les attentes des équipes, le niveau de compétences nécessaires et les outils dont nous disposons.

Plateforme génomique - analyses génomiques

 

Analyse génomique ciblée

  • Génotypage par qPCR TaqMan (Open Array, ThermoFisher)
  • Génotypage de séquences répétées (STR, Promega)
  • Identification de variants structuraux par cartographie optique (Bionano)
  • Caracterisation de variants structuraux par séquençage ciblé Nanopore (adaptive sequencing, guide RNAs/Cas9).

Analyse pangénomique

  • Analyse génomique d’échantillons frais ou congelés à l’aide de puces Cytoscan, ou d’échantillons fixés ou dégradés à l’aide de puces Oncoscan (ThermoFisher)
  • Génotypage haut débit à l’aide de la technologie Axiom (ThermoFisher)
  • Identification de variants structuraux de génomes par cartographie optique (Bionano) d’échantillons frais ou congelés
  • Analyse custom par cartographie optique (Optical replication mapping, Optical repair mapping, méthylation,etc.).

Equipements dédiés à l’analyse génomique :

  • Plateforme Affymetrix ThermoFisher GCS3000
  • Plateforme Affymetrix ThermoFisher Gene Titan 4C
  • Applied Biosystems Real-Time PCR Systems: QuantStudio 12K flex et QuantStudio 5
  • Robot Accufill
  • Système Saphyr, Bionano
  • MinIon, Oxford Nanopore Technologies

Analyses - ARN

L’expression des gènes est complexe et peut être adressée à plusieurs niveaux. Les ARN codants pour les protéines peuvent être quantifiés à l’aide de puces ThermoFisher pour une analyse pan-génomique en interrogeant des dizaines voire centaines de sondes réparties sur les régions exoniques et introniques.

Des approches de multiplexage qPCR ou NanoString peuvent être conçues à façon selon le type, le nombre d’échantillons, la quantité d’ARN disponible et le nombre de marqueurs à quantifier. 

La plateforme propose également d’analyser la régulation de l’expression des gènes en quantifiant les micro ARN et les ARN non codants, par puces ThermoFisher ou par un multiplexage NanoString.

La plateforme peut tester et mettre en œuvre des protocoles dédiés à la préparation de librairies pour l’analyse de transcriptome par RNAseq.

Plateforme génomique - analyses transcriptomiques

 

Analyse transcriptomique ciblée

  • par des approches de multiplexage Nanostring
  • par des approches de PCR quantitatives

Analyse transcriptomique non ciblée

  • par des puces Thermofisher interrogeant les transcrits codants ou non pour des protéines (Clariom D)

Analyse de la régulation de l’expression des gènes

  • Analyse de microARN par puces Thermofisher ou par multiplexage Nanostring
  • Analyse de la méthylation d’ADN par des approches ciblées (HRM) ou génome entier (préparation de librairies WGBS, OxBS)

Pour l’évaluation de nouvelles méthodes d’analyses génomiques, ADN/ARN, n’hésitez pas à nous contacter!

 

Développements

Une partie importante de l'activité de la plateforme est d'implémenter et développer de nouvelles techniques pour répondre aux besoins des équipes qui la sollicitent.

La cartographie optique (Bionano) a été implantée au laboratoire en janvier 2020 et mise en service en juin 2020. Elle permet de détecter des variants structuraux génomiques de grande taille, tels que des insertion, délétions, translocations, répétitions, des régions gagnées ou perdues, des aneuploïdies, …

Plateforme génomique - Bionano cartographie optique
Plateforme génomique - protocole Bionano

 

Des mises au point concernant les étapes d’extraction et de marquages de l’ADN sont actuellement en cours.

En effet, plusieurs méthodes d’extractions d’ADN sont en cours d’évaluation pour répondre à des problématiques de qualité et quantité d’ADN de très haut poids moléculaire obtenus avec la méthode Bionano, à partir de tissus cérébraux et tissus pigmentés. Des tests de double marquage sont également en cours de tests.

Circosplot issu de l’analyse Bionano d’un échantillon de mélanome uvéal :

Pf génomique - Circosplot Bionano

 

Séquençage ciblé de longs fragments par la technologie Nanopore 

Nanopore

La technologie ONT (Oxford Nanopore Technologies) a été implantée au laboratoire en janvier 2022.  Elle permet de séquencer un génome entier, de cibler et enrichir une partie du génome par l’usage de guide ARN, et d’enzyme Cas9 principalement. L’équipe génomique peut prendre en charge le design et le test de cette approche de séquençage ciblé. Une sélection des régions d’intérêt par enrichissement bio-informatique en temps réel ou adaptive sampling (informatique) peut également permettre de cibler le séquençage et d’augmenter la couverture des régions d’intérêt.

Pf génomique_targeted analysis

Exemple d’un séquençage Nanopore après enrichissement Cas9 et adaptative sampling, du gène d’intérêt BAP1 dans le Mélanome Uveal :

Plateforme génomique - séquençage Nanopore

 

Signatures moléculaire et projets collaboratifs internationaux

Depuis 2008, la plateforme a acquis un savoir-faire dans l’évolution d’outils d’analyse génomiques au bénéfice de la médecine moléculaire (médecine de précision, médecine de prédiction de risques), en participant à la mise en place de circuits biologiques s’inscrivant dans des essais cliniques. Ce savoir-faire a permis d’être un acteur majeur au sein de consortium nationaux et internationaux.

  • Essais Remagus04 (Institut Curie, Hôpital Saint Louis, IGR) - 2008 - analyse de l’expression de 30 gènes impliqués dans la réponse à la chimiothérapie - Technologie Affymetrix - Hess et al. (2006)
  • Essai SAFIR01 (UNICANCER) - 2011 – Orienter les patients atteints de cancer du sein vers l’essai clinique le plus adapté selon les altérations génomiques – Technologie Affymetrix- Comparative genomic hybridization array and DNA sequencing to direct treatment of metastatic breast cancer : a multicentre, prospective trial. doi.org/10.1016/S1470-2045(13)70611-9  
  • SAFIR02 (UNICANCER) - 2014 - validation de signatures génomiques ciblables, cancers du sein et du poumon - Technologie Affymetrix. Nature. 2022 Oct;610(7931):343-348. doi.org/10.1038/s41586-022-05068-3. PLoS Med. 2016 Dec 27;13(12):e1002201. doi.org/10.1371/journal.pmed.1002201
  • SHIVA (Institut Curie) - 2013 - analyse des altérations génomiques - Technologie Affymetrix- Molecularly targeted therapy based on tumour molecular profiling versus conventional therapy for advanced cancer (SHIVA): a multicentre, open-label, proof-of-concept, randomised, controlled phase 2 trial  doi.org/10.1016/s1470-2045(15)00188-6
  • Classification COO (LYSARC) - 2015 - Classification de sous types de lymphomes à partir de l’expression de 20 gènes - Technologie Nanostring - Reliable subtype classification of diffuse large B-cell lymphoma samples from GELA LNH2003 trials using the Lymph2Cx gene expression assay. doi.org/10.3324/haematol.2017.166827
  • Essai Neopal -  2013 / Transneopal – 2020  -  signature PAM50 – Classification et prédiction du risque de récidives de cancers du sein à partir de l’expression de 50 gènes - Technologie Nanostring - Prospective, multicenter French study evaluating the clinical impact of the Breast Cancer Intrinsic Subtype-Prosigna® Test in the management of early-stage breast cancers. doi.org/10.1371/journal.pone.0185753
  • MammoRisk  (Predilife) : 2019 – analyse des génotypes prédicteurs de cancer du sein - Technologie ThermoFisher
  • La Ligue/Programme CIT - validation de signatures d’expression de gènes - Technologie Nanostring
  • LabEx Milieu Intérieur (Institut Pasteur) – Technologie Nanostring
  • Projet Européen MAARS : 2014 - analyse du transcriptome - Technologie Affymetrix