Yu Luo (2023)

Characterizing G-quadruplex formation : development and integration of novel assays

Les séquences d'acides nucléiques riches en guanines peuvent adopter des structures secondaires non canoniques nommées G-quadruplexes (G4s). Ces structures ont été identifiées dans différents génomes et participent à de nombreux processus physiologiques. De nombreuses séquences G4s putatives (PQS) ont été identifiées par des analyses bioinformatiques et séquençage par immuno-précipitation de la chromatine (ChIP-seq). Par contre, trouver une séquence relativement riche en guanine ne signifie pas forcément qu'elle forme une structure G4. Le but de cette thèse se concentre sur le développement de nouvelles méthodes d'étude in vitro pour la caractérisation de G4s à haut débit, et la validation d'un grand nombre de PQS.Le transfert d'énergie par résonance de type Föster (FRET) est un puissant outil pour le suivi de la dénaturation d'un G4 intramoléculaire fonctionalisé aux extrémités avec deux sondes: un chromophore donneur (FAM) et un accepteur (TAMRA). À faible température, les deux extrémités sont à proximité, permettant la désactivation de la fluorescence du donneur par FRET. Quand la température augmente, le G4 est dénaturé et les deux extrémités s'éloignent, ce qui restaure graduellement la fluorescence du donneur. La température de dénaturation (Tm) peut être obtenue à partir de la courbe de FRET-melting. Une nouvelle méthodologie nommée FRET-melting compétitive (FRET-MC) a été développée, permettant de suivre 48 échantillons en duplica en 2 heures. Le FRET-MC se base sur la compétition d'un ligand sélectif pour les G4s (PhenDC3) entre un G4 reporteur (FAM-Tel21-TAMRA, F21T) et un compétiteur en large excès dont la structure est inconnue. L'interaction du PhenDC3 avec le G4 formé par F21T induit une stabilisation mesurée par l'augmentation du Tm d'environ 23°C. L'excès de compétiteur G4 va piéger le PhenDC3, ramenant le Tm de F21T à la valeur obtenue sans ligand. Une séquence compétitrice qui ne forme pas une structure G4 n'aura pas d'impact sur l'interaction du PhenDC3 avec F21T. Le FRET-MC est une méthode tolérant une grande variabilité de compétiteurs, excepté ceux présentant une faible stabilité thermique, qui se retrouvent sous forme monocaténaire à la température où F21T commence à se dénaturer. Le FRET isotherme (isso-FRET) a été développé comme une alternative compatible avec des G4s peu stables thermiquement. L'iso-FRET exploite deux RNAs : le 37Q (37-quencher) formant un G4 lorsque stabilisé par le PhenDC3, et le F22 (FAM-22) partiellement complémentaire à 37Q. À ce système est ajouté une séquence compétitrice non marquée. Si le compétiteur ne forme pas de G4, le PhenDC3 stabilise 37Q, empêchant son interaction avec F22, ce qui permet un fort signal de fluorescence de F22. Au contraire, un excès de compétiteur formant un G4 piégera le PhenDC3 qui ne sera plus disponible pour stabiliser 37Q. Il en résulte l'hybridation de 37Q avec F22, provoquant la désactivation de la fluorescence de F22. L'iso-FRET peut être utilisé à température 25°C ou physiologique (37°C), ce qui le rend compatible avec les compétiteurs G4s possédants une faible stabilité thermique. En parallèle, la conformation des séquences riches en CG formant des G4s a été réalisée. La structure des séquences riches en GC est étroitement liée au nombre de cytosines, mais également au ratio de [K⁺] / [Na⁺] présent dans le tampon. Les résultats spectroscopiques montrent que CEB25 tolère des boucles continues de cytosines dans un tampon mixte potassium / sodium. Cela implique que les séquences G4s riches en cytosine peuvent toujours adopter une structure G4 dans l'environnement intracellulaire. Les résultats d'UV-melting mettent en évidence que la présence de cytosines dans les boucles G4 ne diminuent pas leur stabilité, mais augmente la probabilité de former une tige-boucle ou un ADN palindromique bicaténaire en compétition. L'emplacement des PQS riches en cytosines a été étudié par analyse bioinformatique et indique une localisation au niveau des pré-ARNm.