Recherche translationnelle en oncologie pédiatrique (RTOP)

 Laboratoire Gudrun Schleiermacher

Dans le cadre de notre programme de recherche, nous abordons les questions de l'hétérogénéité génétique et épigénétique, de l'évolution clonale et du criblage de médicaments à haut rendement, y compris les combinaisons et les thérapies séquentielles, dans le but de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le neuroblastome et d'autres cancers pédiatriques très agressifs.

Figure 1 : Structure générale de notre programme de recherche

Les travaux de mon équipe se sont concentrés sur la caractérisation moléculaire à grande échelle pour comprendre les mécanismes sous-jacents conduisant à un phénotype observé afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques, dans les cancers pédiatriques à haut risque et en particulier dans le neuroblastome (NB). Le séquençage de l'exome entier/du génome entier, le profilage de l'expression, ainsi que le profilage épigénétique des échantillons de tumeurs, les approches de cellules uniques et les analyses de biopsies liquides séquentielles ont été utilisés pour étudier les événements génétiques clonaux par rapport aux événements génétiques subclonaux, et pour décrire le rôle de l'évolution clonale dans la progression du NB. Nos travaux de ces dernières années ont abouti aux résultats suivants :

1) Découverte de l'impact pronostique du profil global du nombre de copies génomiques chez les patients atteints de neuroblastome et de son utilité dans la gestion clinique des patients
Pertinence : Intégration du profil génomique du nombre de copies pour la stratification des patients et la détermination de l'intensité du traitement dans le protocole européen pour le neuroblastome à risque faible et intermédiaire (LINES) et dans les protocoles de traitement aux États-Unis (Children's Oncology Group, COG). Sur la base de ces travaux, la détermination d'un profil global du nombre de copies génomiques dans le neuroblastome à risque faible/intermédiaire est désormais considérée comme une norme de soins pour la gestion clinique de ces patients.

2) Rôle des altérations génétiques activant l'ALK chez les patients atteints de neuroblastome
Description de la fréquence et de l'impact pronostique des altérations génétiques ALK dans les neuroblastomes à haut risque, et de l'apparition de mutations ALK subclonales au moment du diagnostic du neuroblastome ; découverte de l'émergence de mutations ALK activatrices lors de la rechute du neuroblastome.
Pertinence : Ces informations constituent un élément essentiel du rationnel d'une initiative transatlantique avec des protocoles de traitement introduisant un inhibiteur d'ALK en première ligne de traitement, en parallèle à la chimiothérapie standard, pour les patients atteints de neuroblastome à haut risque ALK-positif. Ces nouveaux protocoles de traitement (COG et SIOPEN) seront lancés en 2021. En tant que président du comité de biologie de SIOPEN, je coordonnerai les activités de recherche translationnelle correspondantes de SIOPEN.

3) Rôle des mutations ALK et MAPK dans l'évolution clonale et la progression tumorale du neuroblastome
Pertinence : Nos résultats ont contribué de manière significative à la modification de la pratique clinique en cas d'échec du traitement de première ligne dans le neuroblastome : dans le cadre des programmes de médecine de précision visant à établir un profil moléculaire pour identifier des cibles thérapeutiques moléculaires après l'échec du traitement de première ligne (MAPPYACTS, INFORM, etc), plutôt que d'effectuer de telles analyses moléculaires à haut rendement sur du matériel biologique d'archive, une nouvelle biopsie/un nouvel échantillon de tumeur obtenu au moment de la rechute ou de la progression est maintenant considéré comme un standard, lors de l'analyse du tissu tumoral pour rechercher des cibles génétiques ciblables/actionnables.

4) L'analyse de l'ADN tumoral circulant documente l'hétérogénéité tumorale spatiale et temporelle dans le neuroblastome et d'autres cancers pédiatriques
Faisabilité de l'analyse de l'ADN tumoral circulant pour étudier les altérations génétiques spécifiques des cellules tumorales ; hétérogénéité entre la tumeur primaire et l'ADN tumoral circulant ; évolution temporelle des altérations génétiques moléculaires
Pertinence : Nos études ont largement contribué à la démonstration de l'utilité de l'ADN tumoral circulant, isolé à partir d'un simple échantillon de sang, pour étudier les altérations spécifiques des cellules tumorales ; ces approches sont maintenant largement utilisées dans les essais cliniques et biologiques prospectifs dans le domaine de la recherche sur le neuroblastome.

Ces faits marquants s'appuient également sur une forte implication dans les réseaux de recherche nationaux, internationaux et transatlantiques.  Ces étapes ont un impact majeur, tant au niveau de la prise en charge clinique et des nouveaux essais cliniques pour les patients atteints de neuroblastome ou d'autres cancers pédiatriques à haut risque, qu'au niveau de la compréhension des mécanismes moléculaires, ouvrant la voie à de nouveaux projets de recherche.

Objectifs de recherche en cours

Nous nous pencherons également sur les questions d'hétérogénéité génétique et épigénétique, d'évolution clonale, et nous développerons le criblage de médicaments à haut rendement, y compris les combinaisons et les thérapies séquentielles, dans le but de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le neuroblastome et d'autres cancers pédiatriques très agressifs. Les travaux de mon équipe s'articulent autour des axes suivants :

Hétérogénéité spatiale des tumeurs - Étude de l'hétérogénéité génétique/épigénétique des tumeurs, y compris au niveau d'une seule cellule      

<Neuroblastome hypermuté : Nous avons identifié 19/150 cas de neuroblastome avec une charge mutationnelle tumorale (TMB) intermédiaire ou élevée. Les gènes de réparation des mésappariements, ou d'autres gènes impliqués dans la réparation de l'ADN, ont été trouvés altérés dans 5 et 7 cas, respectivement.  Nous analyserons ce sous-groupe NB en détail pour comparer la charge tumorale globale et les signatures mutationnelles entre la tumeur primaire et la rechute, et pour rechercher des profils mutationnels potentiellement induits par la thérapie, et nous appliquerons des pipelines bio-informatiques déjà établis pour la prédiction de néo-antigènes.

< Étude du rôle des gènes de remodelage de la chromatine dans le NB : nous avons récemment fait état du rôle possible des gènes de remodelage de la chromatine et en particulier de SMARCA4 dans le NB. Nous allons maintenant étudier plus en détail l'effet de la perte de SMARCA4 dans le contexte du NB, en étudiant les effets de la réexpression de SMARCA4 dans la lignée cellulaire SKNFI SMARCA4 - en termes de viabilité et de prolifération, de morphologie cellulaire, d'expression génique et de modifications des marques d'histone H3K27me3, H3K27ac, et H3K4me3

< Analyse du rôle de l'hétérogénéité génétique au niveau de la cellule unique dans le neuroblastome : L'hétérogénéité génétique au niveau de la cellule unique sera explorée plus avant afin d'identifier les événements cellulaires synergiques, à la fois dans la tumeur primaire et dans les cellules tumorales disséminées (DTC) dans la moelle osseuse. Le séquençage de l'ARN (en collaboration avec I Janoueix-Lerosey, U830) et de l'ADN au niveau de la cellule unique dans le NB est effectué, en étudiant des échantillons de patients (tumeur primaire/moelle osseuse) et des modèles PDX (xénogreffes dérivées de patients) du NB. Des approches ATACseq seront utilisées pour comparer les informations épigénétiques avec celles de l'ADN/ARN. Ces travaux visent à mettre en évidence la cooccurrence des altérations génétiques au niveau d'une seule cellule et les mécanismes de coopération entre des cellules génétiquement et épigénétiquement distinctes.

Hétérogénéité tumorale temporelle et son rôle dans l'évolution clonale du neuroblastome

Nous poursuivrons notre objectif d'une description complète des altérations génétiques observées de manière temporelle chez les patients atteints de neuroblastome, afin d'étudier l'évolution clonale et son rôle dans la progression de la tumeur, ainsi que les mécanismes d'échappement et de résistance au traitement. Pour ce faire, nous étudierons le séquençage de l'exome entier cfDNA, combiné à un séquençage ciblé, ainsi que l'inférence des profils d'expression par empreinte nucléosomique dans des échantillons de plasma séquentiels. Nos approches seront également appliquées à des modèles PDX soumis à des traitements ciblés ou combinés. En outre, nous explorerons les modulations des changements épigénétiques et de l'identité cellulaire au cours de l'évolution de la maladie dans le neuroblastome, en utilisant notre technique récemment développée de ChIPSeq sur des échantillons de plasma de patients NB, en utilisant des anticorps contre H3K4me3 (marque épigénétique active), H3K27me3 (marque épigénétique répressive), et H3K27ac (marque épigénétique d'enhancement).

Figure 2 : L'évolution clonale étudiée par l'analyse séquentielle de l'ADNcf  (Bobin, Iddir et al 2024)

Développement et évaluation de thérapies ciblées innovantes  

En collaboration avec la plateforme Biophenics (Dr Elaine Del Nery, Département de Transfert), nous avons mis en place un criblage de médicaments à haut rendement sur des cellules tumorales dérivées de PDX (PDTC) en utilisant des bibliothèques de médicaments. Nous poursuivrons l'exploration des combinaisons et en particulier des propositions de traitement séquentiel en fonction des profils génétiques des différents modèles. Sur la base de l'hypothèse selon laquelle la stabilisation de G4 par des ligands G4 (G4-L) pourrait surmonter la chimiorésistance par létalité synthétique dans les cellules présentant un stress réplicatif (telles que les NB avec perte d'ATRX), nous déterminerons la sensibilité sélective des lignées cellulaires NB ATRX-LoF et MYCNa à un panel de ligands G4, et explorerons ainsi le mécanisme de létalité synthétique par lequel G4-L pourrait resensibiliser les NB aux chimiothérapies standard. Notre but ultime est d'améliorer les approches thérapeutiques actuelles pour le NB en établissant une nouvelle génération de profils de sensibilité et de résistance aux médicaments dans les PDTC.

Etudes cliniques prospectives

Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de l'oncogenèse et de l'éventuelle résistance au traitement et progression tumorale, le programme national MICCHADO (Molecular and immunological Characterization of high risk childhood cancer at diagnosis ; PI Gudrun Schleiermacher) vise une caractérisation moléculaire et immunologique détaillée des enfants et adolescents atteints de cancer à haut risque au moment du diagnostic, et le suivi des biomarqueurs identifiés dans des échantillons sanguins séquentiels pendant le traitement et le suivi, y compris l'étude de l'ADNct. Lancée en 2018, à ce jour nous avons déjà recruté 310 / 600 patients attendus dans cette étude prospective.

La caractérisation moléculaire dans le cadre du programme France Médecine Génomique 2025 vise à introduire le séquençage à haut débit (HTS : WES, WGS et RNAseq) dans les soins standards.  Je coordonne le programme national FMG2025 HTS pour les enfants et adolescents atteints de cancer en échec thérapeutique, dans le but d'identifier des altérations génétiques ciblables, et je coordonne, au nom de la Société Française d'Oncologie Pédiatrique, l'introduction du HTS pour les enfants et adolescents atteints de cancer au moment du diagnostic.

En résumé, le programme de recherche de notre équipe se concentre en particulier sur les aspects suivants :

1. Hétérogénéité spatiale des tumeurs - Étude de l'hétérogénéité génétique et épigénétique des tumeurs
Détermination de la fréquence des altérations génétiques ciblables dans les échantillons de neuroblastomes
Analyse du rôle de l'hétérogénéité génétique au niveau d'une seule cellule dans le neuroblastome

2. Hétérogénéité temporelle
Identification des mécanismes d'évolution de la tumeur et des mécanismes d'échappement et de résistance au traitement, sur la base d'analyses moléculaires séquentielles utilisant des biomarqueurs circulants / biopsies liquides dans le neuroblastome

3. Développement et évaluation de thérapies ciblées innovantes 
Étude de modèles in vivo pertinents par des essais de médicaments ciblés et combinés et étude de l'évolution clonale dans le neuroblastome

4. Études et essais cliniques prospectifs 
Programmes de séquençage clinique - Caractérisation moléculaire des cancers pédiatriques à haut risque : vers un "standard de soins" de caractérisation moléculaire à haut débit Caractérisation moléculaire dans le cadre du programme France Médécine Génomique 2025         
Développement d'essais cliniques - Développement d'une étude transatlantique COG (USA) - SIOPEN (Europe) introduisant un traitement ciblé ALK en première ligne dans les neuroblastomes à haut risque avec altérations génétiques ALK

Laboratoire Franck Bourdeaut

Our project is focusing on SMARCB1 gene and related cancers, and encompasses translational aspects together with some more basic science.

Les aspects translationnels couvrent différents axes liés aux échantillons humains obtenus dans le cadre de l'activité clinique de notre département : 

1) des études ancillaires d'essais cliniques en cours, principalement au niveau européen : cela comprendra la caractérisation moléculaire prospective (méthylation, transcriptomique, protéomique.... ) d'échantillons français de patients inclus dans l'essai SIOPe ATRT01 (EUDRACT : 2018-003335-29), et l'établissement de modèles dérivés de patients (xénogreffes, organoïdes, lignées cellulaires...) ; des analyses unicellulaires sont également prévues sur des échantillons frais et le liquide céphalorachidien sera stocké prospectivement afin de réaliser des analyses sérielles de l'ADNct tout au long du traitement. Les aspects scientifiques et techniques seront partagés avec d'autres équipes jouant également un rôle clé dans les études auxiliaires des essais cliniques et abordant des questions similaires (Gudrun Schleiermacher, Olivier Ayrault).

2) l'établissement de modèles précliniques ; cela couvre essentiellement la collecte prospective de xénogreffes dérivées de patients sur des sous-types de tumeurs qui ne sont pas déjà couverts par notre collection actuelle. L'objectif principal de l'établissement de ces collections est de pouvoir participer à des essais précliniques collaboratifs, décidés soit au niveau de notre unité, soit, plus probablement, dans le cadre de collaborations européennes.

3) définir les phénotypes associés aux variants germinaux de SMARCB1 ou SMARCA4, afin de mieux prédire le devenir des individus porteurs de ces variants germinaux. L'objectif principal est de collecter des données cliniques et des échantillons biologiques (tissus normaux, échantillons de tumeurs) d'individus porteurs de tels variants et de caractériser les caractéristiques génomiques et épigénétiques qui peuvent expliquer la variété des phénotypes observés dans ces contextes. Nous entamons également une collaboration visant à établir des modèles précliniques ex-vivo dérivés de cellules normales de patients présentant de tels syndromes de prédisposition.

Notre laboratoire s'intéresse également à la question de la lignée d'origine des tumeurs rhabdoïdes

En développant divers modèles de souris ciblant Smarcb1 dans divers progéniteurs embryonnaires, nous cherchons à décrire quelles cellules sont susceptibles de subir une transformation oncogénique lors de l'inactivation de Smarcb1. Nous avons démontré que tous les types de cellules et toutes les fenêtres de développement ne sont pas susceptibles de permettre le développement d'une tumeur rhabdoïde. Nous ciblons maintenant des progéniteurs plus restreints afin d'affiner les lignées potentielles d'origine des tumeurs rhabdoïdes et d'autres cancers déficients en Smarcb1.

Parallèlement, nous prélevons des tumeurs fraîches sur des modèles murins et des patients afin d'approfondir l'étude de l'hétérogénéité intra-tumorale et de mieux comprendre les trajectoires des cellules tumorales rhabdoïdes.

Figure 1 : corrélation entre le profilage moléculaire et la structure anatomique d'origine des tumeurs humaines (panneau supérieur) et des tumeurs de souris (panneau inférieur) ; analyses respectives de cellules uniques et déductions de trajectoires (panneaux de droite).

Trouver des vulnérabilités au sein d'autres acteurs épigénétiques

Nous cherchons également à identifier les vulnérabilités des cellules déficientes en SMARCB1 et les mécanismes de résistance aux nouveaux médicaments, en particulier les modificateurs épigénétiques. Nous souhaitons étudier par exemple l'hétérogénéité épigénétique intra-tumorale, qui peut expliquer la résistance des tumeurs ; alors que le paysage génétique de ces tumeurs est très simple et presque normal, l'hétérogénéité morphologique et l'hétérogénéité intra-tumorale des sous-unités SWI/SNF mérite d'être étudiée en profondeur, en utilisant des approches de cellules uniques<. Ceci sera développé en étroite collaboration avec l'équipe d'Olivier Ayrault qui est en charge du développement de la technologie protéomique unicellulaire dans notre Institut.

Nous nous efforçons enfin de découvrir comment le système immunitaire pourrait être utilisé pour maîtriser les cancers déficients en Smarcb1.

Conformément à nos découvertes antérieures selon lesquelles un sous-ensemble de cancers déficients en Smarcb1 sont en fait gonflés par des cellules immunitaires qui peuvent reconnaître certains néo-épitopes spécifiques du cancer encore inconnus, nous suivons deux axes différents pour spécifier la place des thérapies basées sur le système immunitaire :

1) par des analyses unicellulaires de cellules T triées à partir d'échantillons frais de tumeurs humaines et murines, nous étudions si certains clones élargis de cellules T peuvent aider à prédire, à partir d'analyses in silico et in vitro, quels sont les néo-épitopes reconnus ; le but ultime est de développer des thérapies à base de cellules T à partir de ces résultats.

2) par des analyses unicellulaires des cellules myéloïdes, nous cherchons à mieux comprendre comment ces cellules peuvent agir en faveur ou en défaveur du développement tumoral et comment elles pourraient être reprogrammées d'une manière thérapeutiquement efficace.

Ce programme est réalisé en étroite collaboration avec les équipes de Josh Waterfall et Eliane Piaggio.

Figure 2 : analyses de cellules uniques sur des échantillons humains décrivant les populations immunitaires qui infiltrent les tumeurs déficientes en Smarcb1 ; surexpression des ERV dans la lignée cellulaire déficiente en SMARCB1 (panneau supérieur droit), comme source potentielle de néo-antigènes reconnus par les cellules T en expansion clonale (montrées dans le panneau inférieur moyen) ; impact pro-tumoral des cellules myéloïdes observé dans la souche de souris DTR privée de cellules myéloïdes, après greffe avec notre modèle murin de tumeurs rhabdoïdes.

Dans l'ensemble, notre programme se situe à la frontière entre la recherche translationnelle et la recherche fondamentale, en se concentrant sur trois axes principaux, à savoir la biologie du développement liée à l'oncogenèse, la réponse immunologique et la découverte de néo-antigènes non canoniques, et l'hétérogénéité épigénétique dans la perspective de traitements à base d'épidrugs. Nos liens étroits avec des groupes de collaboration européens dans le domaine et le département de pédiatrie clinique de notre institut offrent une configuration extrêmement favorable pour traduire les résultats de l'unité en clinique.