Hétérogénéité et plasticité du microenvironnement tumoral

Depuis plusieurs années, notre équipe de recherche s’attache à caractériser le microenvironnement tumoral, notamment dans les cancers du sein et de l’ovaire. Les fibroblastes associés au cancer ou CAF (Cancer Associated Fibroblast) constituent l’un de ses composants abondants. Leur rôle au sein des tumeurs a longtemps été sous-estimé. Les CAF exercent pourtant des fonctions pro-tumorales clefs : ils favorisent la progression et la dissémination des cellules tumorales; ils participent également à déjouer la surveillance du système immunitaire. Et ils sont enfin impliqués dans la résistance aux traitements. 

1. Hétérogénéité des CAF dans les cancers

Compte tenu du rôle important des CAF dans les cancers (Toullec et al., EMBO Mol. Med. 2010 ; Costa et al., Seminars in Cancer Biology, 2014; Mhaidly et al, Seminars in Immunology, 2020; Mhaidly et al, Immunol Rev, 2021), nous avons entrepris de caractériser leur hétérogénéité au sein du microenvironnement tumoral. Caractériser l’hétérogénéité des CAF est un enjeu majeur afin de réaliser une cartographie précise des tumeurs et comprendre leurs fonctions distinctes au sein de la niche tumorale, tout au long de la progression cancéreuse, et lors du traitement des patients. L’identification et la définition précise de sous-populations fibroblastiques ayant un rôle clé dans l’échappement tumoral et la résistance au traitement permettront de proposer de nouvelles pistes diagnostiques et thérapeutiques dont pourraient bénéficier les patients.

Grâce à l’analyse d’échantillons de patientes nous avons identifié 4 sous-populations de CAF (dénommées CAF-S1, -S2, -S3, -S4) dans les cancers du sein et de l’ovaire (Costa et al, Cancer Cell, 2018 ; Givel et al, Nature Communications, 2018).  Chacune de ces populations de CAF est caractérisée par l’expression de marqueurs spécifiques. De manière intéressante, ces sous-populations de CAF s’accumulent dans des proportions distinctes en fonction des sous-types de cancers du sein (Luminal, HER2 et Triple-Négative) et de l’ovaire (mésenchymateux/non-mésenchymateux). Ainsi, les CAF-S2 et CAF-S3 sont non seulement observés dans les tumeurs, mais aussi dans les tissus juxta-tumoraux normaux, suggérant qu’ils pourraient provenir de fibroblastes normaux détectés dans les tissus sains.  Au contraire, les myofibroblastes CAF-S1 et CAF-S4 sont présents exclusivement dans les tumeurs. Par ailleurs, les deux populations myofibroblastiques CAF-S1 et CAF-S4 s’accumulent dans des cancers agressifs ce qui suggère qu’ils jouent un rôle majeur dans la progression tumorale.

Ces 4 sous-types de CAF sont également détectés dans d’autres cancers, ce qui souligne leur relevance biologique (Kieffer et al, Cancer Discovery, 2020).

 

2. Fonctions des fibroblastes CAF-S1 et CAF-S4 dans les cancers

Les fibroblastes CAF-S1 (SMA⁺ FAP⁺ CD29^med-high) possèdent à la fois des fonctions immunosuppressiveset pro-métastatiques (Costa et al, Cancer Cell, 2018; Givel et al, Nature Communications, 2018; Bonneau et al, Breast Cancer Research, 2020; Pelon et al, Nature communications, 2020 ; Kieffer et al, Cancer Discovery, 2020).

• Les fibroblastes CAF-S1 sont immunosuppresseurs

Nos études sur les cancers du sein et de l’ovaire ont démontré que les fibroblastes CAF-S1 sont capables de réduire l’activité de défense du système immunitaire. Les CAF-S1 favorisent l’attraction des lymphocytes T et stimulent leur différenciation en lymphocytes T régulateurs au détriment des lymphocytes T cytotoxiques, entrainant ainsi un microenvironnement immunosuppresseur. En effet, en sécrétant la chimiokine CXCL12, les fibroblastes CAF-S1 attirent les lymphocytes CD4+ CD25+ puis les retiennent grâce aux ligands OX40L, PD-L2 et JAM2 exprimés à leur surface. Enfin les CAF-S1 induisent la différenciation de ces lymphocytes CD4+ CD25+ en lymphocytes T régulateurs (FOXP3+) qui entrainent la diminution de la prolifération des cellules T effectrices (Costa et al, Cancer Cell, 2018 ; Givel et al, Nature Communications, 2018 ; Brevet WO2019020728A1).  

 

• Les fibroblastes CAF-S1 et CAF-S4 stimulent la propagation métastatique par des mécanismes complémentaires

Après avoir caractérisé les populations de CAF dans les tumeurs primaires, nous avons étudié la composition fibroblastique des métastases axillaires lymphatiques chez les patientes atteintes de cancers du sein. Nous avons observé que les 4 populations de CAF (CAF-S1, -S2, -S3, -S4) sont détectées dans les nodules lymphatiques métastatiques mais les proportions de fibroblastes CAF-S1 et CAF-S4 sont corrélées au nombre de cellules tumorales envahissant le tissu. Ainsi, les fibroblastes CAF-S1 et CAF-S4 s’accumulent non seulement dans les tumeurs agressives, mais également dans les nodules lymphatiques métastatiques. Enfin, le contenu en CAF-S1 et CAF-S4 dans ces nodules est un nouveau marqueur de mauvais pronostic, indiquant -au moment du diagnostic- un risque élevé de récidive tardive et de métastases à distance (Pelon et al, Nature Communications, 2020).

 

Par des analyses fonctionnelles combinant des expertises interdisciplinaires en Biologie et Physique, nous avons démontré que les fibroblastes CAF-S1 et CAF-S4 exercent des activités pro-métastatiques et coopèrent grâce à des mécanismes complémentaires. Les CAF-S1 initient la transition des cellules cancéreuses épithéliales en cellules mésenchymateuses et stimulent leur migration ; les CAF-S4 promeuvent leur capacité d’invasion, démontrant ainsi les actions synergiques de ces deux sous-populations dans le développement métastatique (Pelon et al, Nature Communications, 2020). 

 

Les cancers du sein luminaux précoces T1N0 (tumeurs inférieures à 2cm) sont peu étudiés car le plus souvent de bon pronostic. Cependant, dans 5% des cas, ce cancer progresse avec le développement de métastases entrainant la rechute thérapeutique des patientes. D’un point de vue clinique, il est donc primordial d’anticiper ces réponses afin de développer de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous avons comparé un groupe de patientes ayant rechutées, et un groupe « contrôle » n’ayant pas développé de métastases. Or, les patientes qui ont développé des métastases possèdent, au sein de leur tumeur primaire, un enrichissement de fibroblastes CAF-S1. Cette étude montre, une nouvelle fois, que les fibroblastes CAF-S1 sont un marqueur de mauvais pronostic et associé à un risque élevé de récidive. Les métastases issues des cancers du sein luminaux sont majoritairement osseuses. Or, les fibroblastes CAF-S1 participent activement à la formation de métastases en induisant la migration des cellules tumorales par l’action de la cadhérine ostéoblastique CDH11 (Bonneau et al, Breast Cancer Research, 2020).

3. Hétérogénéité cellulaire des fibroblastes CAF-S1 dans les cancers du sein

• Identification de sous-populations cellulaires CAF-S1

Les fibroblastes CAF-S1 possèdent à la fois des fonctions pro-métastatiques et immunosuppressives. Compte tenu de ces observations, nous avons entrepris de caractériser en profondeur l’hétérogénéité des CAF-S1, grâce à des analyses de séquençage sur cellule unique (single-cell RNAseq). Le séquençage de plus de 18.000 fibroblastes CAF-S1 isolés de cancers du sein nous a permis d’identifier 8 clusters cellulaires différents, associé à des signatures spécifiques. Parmi ces 8 sous-populations, 5 clusters sont des CAF myofibroblastiques ou myCAF (clusters ECM-myCAF, wound-myCAF, TGFβ-myCAF, INF⍺/β-myCAF et acto-myCAF). Les 3 autres clusters de fibroblastes CAF-S1 sont apparentés aux CAF « inflammatoires » ou iCAF (detox-iCAF, il-iCAF, IFN𝛾-iCAF), caractérisés par une forte expression de molécules pro-inflammatoires et de chimiokines (Kieffer et al, Cancer Discovery, 2020).

 

• Les clusters ECM-myCAF et TGFβ-myCAF induisent un microenvironnement immunosuppresseur

Compte tenu de la fonction immunosuppressive des CAF-S1, nous avons démontré que cette propriété était, en fait, portée spécifiquement par certains clusters. En effet, nous avons montré que les fibroblastes ECM-myCAF et TGFβ-myCAF sont corrélés à la présence de lymphocytes T régulateurs (CD4+ Treg) et inversement corrélés à la présence de lymphocytes T cytotoxiques (CD8+), démontrant leur association avec un environnement immunosuppresseur enrichis en Treg. En étudiant les mécanismes moléculaires impliqués dans cette association nous avons mis à jour une interaction réciproque entre les fibroblastes ECM-myCAF, TGFβ-myCAF et les Treg :

1. Les fibroblastes ECM-myCAF jouent sur la proportion de Treg (CD4+ CD25+ FOXP3+) en augmentant l’expression des protéines PD-1 et CTLA-4 à la surface de ces cellules.
2. En retour, les Treg promeuvent la conversion des fibroblastes ECM-myCAF en TGFβ-myCAF (Kieffer et al, Cancer Discovery, 2020).

 

• Les clusters ECM-myCAF, TGFβ-myCAF et wound-myCAF sont indicatifs de la résistance aux immunothérapies

Compte tenu de leur rôle dans la régulation de PD-1 et CTLA-4, nous avons étudié si ces clusters fibroblastiques pouvaient être prédictifs de la réponse aux immunothérapies, chez des patients atteints de mélanomes et de cancers du poumon non-à-petites cellules (NSCLC) métastatiques. De manière très intéressante, les clusters fibroblastiques ECM-myCAF, TGFβ-myCAF et wound-myCAF sont enrichis au diagnostic chez les patients ne répondant pas à l’immunothérapie, suggérant que les fibroblastes ECM-myCAF, TGFβ-myCAF et wound-myCAF sont prédictifs de la résistance aux immunothérapies dans les cancers (Kieffer et al, Cancer Discovery, 2020 ; Brevet EP20305454).  Ainsi, nos analyses suggèrent que cibler le microenvironnement tumoral et en particulier les clusters de CAF-S1 pourrait être une stratégie thérapeutique pertinente, en combinaison avec les traitements actuels et notamment l’immunothérapie.

 

Cette étude a permis un niveau d’analyse et de caractérisation des CAF jusqu’alors jamais atteint et rend compte de la complexité de cette population cellulaire au sein des tumeurs. Les interactions entre ces différents clusters cellulaires avec les cellules immunitaires et cancéreuses nous permettent d’avoir une vision intégrée de la biologie des tumeurs et une compréhension plus complète des mécanismes induisant leur dérégulation. Ces découvertes démontrent le rôle majeur des CAF dans la progression cancéreuse et les mécanismes de résistance aux traitements et permettent de mettre à jour de nouveaux leviers diagnostique et thérapeutiques pour les patients atteints de cancers.

4. Myofibroblastes et rigidité tumorale dans les cancers ovariens

Les cancers de l’ovaire séreux de haut grade ou HGSOC (High Grade Serous Ovarian Cancer) font partis des cancers gynécologiques les plus agressifs, en particulier pour les patientes atteintes de sous-type moléculaire mésenchymateux, identifié notamment par notre laboratoire (Mateescu et al., Nature Medicine, 2011 ; Batista et al., Nature Communications, 2016 ; Kieffer et al., Frontiers in Genetics, 2020). Ces patientes sont caractérisées par un fort contingent de myofibroblastes et une accumulation des protéines de la matrice extracellulaire (Givel et al, Nature Communications, 2018 ; Mieulet et al, Scientific Reports, 2021). Les myofibroblastes sont des fibroblastes activés, contractiles, exprimant de façon constitutive l’actine musculaire lisse. Nous avons caractérisé le rôle de ce contingent myofibroblastique dans la rigidité et l’agressivité tumorale. Nous avons observé une différence majeure en fonction du sous-type moléculaire de HGSOC : les tumeurs mésenchymateuses présentent une plus forte rigidité au cours de la croissance tumorale que les tumeurs non-mésenchymateuses. En effet la rigidité des tumeurs mésenchymateuse est directement associée au contingent myofibroblastique. Plus les tumeurs sont enrichies en CAF myofibroblastiques, plus elles présentent une forte densité de collagène et plus elles sont rigides. De plus, notre étude démontre que la rigidité induite par l’enrichissement myofibroblastique joue un rôle central dans l’agressivité des tumeurs ovariennes car elle corrèle avec l’activation de la voie MAPK/MEK et entraine un switch métabolique glycolytique, à la fois des cellules tumorales épithéliales et des cellules stromales (Mieulet et al, Scientific Reports, 2021).

5. Perspectives de recherche :

Les questions soulevées par ces récentes découvertes nous poussent à explorer et caractériser davantage l’hétérogénéité des fibroblastes CAF-S1. Déterminer la cellule d’origine et les mécanismes par lesquels la diversité cellulaire de la population CAF-S1 est générée est une des questions centrales de nos études grâce au développement de techniques de pointe, dont séquencage ARN sur cellule unique, transcriptomique spatiale et immunohistochimie multiplex. Réaliser une cartographie fine du microenvironnement tumoral dans le temps et dans l’espace nous permettra de rendre compte des affinités et interactions entre les différents types cellulaires composant la niche tumorale et ainsi déterminer leur rôle dans la progression cancéreuse et la résistance aux traitements. La caractérisation complète du microenvironnement tumoral nous permettra de proposer de nouvelles pistes diagnostiques et thérapeutiques aux patients atteints de cancer.

Publications associées de l’équipe :

• Mhaidly, R. and Mechta-Grigoriou F. Inflammatory fibroblasts make rectal cancer resistant to radiation therapy." Cancer Cell, 2022 40(2): 122-124. https://doi.org/10.1016/j.ccell.2022.01.005
• Peltier, A., Seban RD., Bidard FC., Buvat I., Mechta-Grigoriou F. Fibroblast heterogeneity in solid tumors: From single cell analysis to whole-body imaging. Seminars in Cancer Biology, 2022 https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2022.04.008 
• Mhaidly, R.; Mechta-Grigoriou, F. Role of Cancer-Associated Fibroblast Subpopulations in Immune Infiltration, as a New Means of Treatment in Cancer. Immunol Rev 2021. https://doi.org/10.1111/imr.12978.
• Mieulet, V.; Garnier, C.; Kieffer, Y.; Guilbert, T.; Nemati, F.; Marangoni, E.; Renault, G.; Chamming’s, F.; Vincent-Salomon, A.; Mechta-Grigoriou, F. Stiffness Increases with Myofibroblast Content and Collagen Density in Mesenchymal High Grade Serous Ovarian Cancer. Scientific Reports 2021, 11 (1), 4219. https://doi.org/10.1038/s41598-021-83685-0.
• Mhaidly, R.; Mechta-Grigoriou, F. Fibroblast Heterogeneity in Tumor Micro-Environment: Role in Immunosuppression and New Therapies. Seminars in Immunology 2020, 101417. https://doi.org/10.1016/j.smim.2020.101417.
• Kieffer, Y.; Hocine, H. R.; Gentric, G.; Pelon, F.; Bernard, C.; Bourachot, B.; Lameiras, S.; Albergante, L.; Bonneau, C.; Guyard, A.; Tarte, K.; Zinovyev, A.; Baulande, S.; Zalcman, G.; Vincent-Salomon, A.; Mechta-Grigoriou, F. Single-Cell Analysis Reveals Fibroblast Clusters Linked to Immunotherapy Resistance in Cancer. Cancer Discovery 2020, 10 (9), 1330–1351. https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-19-1384.
• Kieffer, Y.; Bonneau, C.; Popova, T.; Rouzier, R.; Stern, M.-H.; Mechta-Grigoriou, F. Clinical Interest of Combining Transcriptomic and Genomic Signatures in High-Grade Serous Ovarian Cancer. Frontiers in Genetics 2020, 11. https://doi.org/10.3389/fgene.2020.00219.
• Bonneau, C.; Eliès, A.; Kieffer, Y.; Bourachot, B.; Ladoire, S.; Pelon, F.; Hequet, D.; Guinebretière, J.-M.; Blanchet, C.; Vincent-Salomon, A.; Rouzier, R.; Mechta-Grigoriou, F. A Subset of Activated Fibroblasts Is Associated with Distant Relapse in Early Luminal Breast Cancer. Breast Cancer Research 2020, 22 (1), 76. https://doi.org/10.1186/s13058-020-01311-9.
• Pelon, F.; Bourachot, B.; Kieffer, Y.; Magagna, I.; Mermet-Meillon, F.; Bonnet, I.; Costa, A.; Givel, A.-M.; Attieh, Y.; Barbazan, J.; Bonneau, C.; Fuhrmann, L.; Descroix, S.; Vignjevic, D.; Silberzan, P.; Parrini, M. C.; Vincent-Salomon, A.; Mechta-Grigoriou, F. Cancer-Associated Fibroblast Heterogeneity in Axillary Lymph Nodes Drives Metastases in Breast Cancer through Complementary Mechanisms. Nature Communications 2020, 11 (1), 404. https://doi.org/10.1038/s41467-019-14134-w.
• Costa, A.; Kieffer, Y.; Scholer-Dahirel, A.; Pelon, F.; Bourachot, B.; Cardon, M.; Sirven, P.; Magagna, I.; Fuhrmann, L.; Bernard, C.; Bonneau, C.; Kondratova, M.; Kuperstein, I.; Zinovyev, A.; Givel, A.-M.; Parrini, M.-C.; Soumelis, V.; Vincent-Salomon, A.; Mechta-Grigoriou, F. Fibroblast Heterogeneity and Immunosuppressive Environment in Human Breast Cancer. Cancer Cell 2018, 33 (3), 463-479.e10. https://doi.org/10.1016/j.ccell.2018.01.011.
• Givel, A.-M.; Kieffer, Y.; Scholer-Dahirel, A.; Sirven, P.; Cardon, M.; Pelon, F.; Magagna, I.; Gentric, G.; Costa, A.; Bonneau, C.; Mieulet, V.; Vincent-Salomon, A.; Mechta-Grigoriou, F. MiR200-Regulated CXCL12β Promotes Fibroblast Heterogeneity and Immunosuppression in Ovarian Cancers. Nature Communications 2018, 9. https://doi.org/10.1038/s41467-018-03348-z.
• Batista, L.; Bourachot, B.; Mateescu, B.; Reyal, F.; Mechta-Grigoriou, F. Regulation of MiR-200c/141 Expression by Intergenic DNA-Looping and Transcriptional Read-Through. Nature Communications 2016, 7. https://doi.org/10.1038/ncomms9959.
• Costa, A.; Scholer-Dahirel, A.; Mechta-Grigoriou, F. The Role of Reactive Oxygen Species and Metabolism on Cancer Cells and Their Microenvironment. Seminars in Cancer Biology 2014, 25, 23–32. https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2013.12.007.
• Mateescu, B.; Batista, L.; Cardon, M.; Gruosso, T.; de Feraudy, Y.; Mariani, O.; Nicolas, A.; Meyniel, J.-P.; Cottu, P.; Sastre-Garau, X.; Mechta-Grigoriou, F. MiR-141 and MiR-200a Act on Ovarian Tumorigenesis by Controlling Oxidative Stress Response. Nature Medicine 2011, 17 (12), 1627–1635. https://doi.org/10.1038/nm.2512.

Toullec, A.; Gerald, D.; Despouy, G.; Bourachot, B.; Cardon, M.; Lefort, S.; Richardson, M.; Rigaill, G.; Parrini, M.-C.; Lucchesi, C.; Bellanger, D.; Stern, M.-H.; Dubois, T.; Sastre-Garau, X.; Delattre, O.; Vincent-Salomon, A.; Mechta-Grigoriou, F. Oxidative Stress Promotes Myofibroblast Differentiation and Tumour Spreading