Joël Lefebvre (2017)

Outils moléculaires pour l'étude des G-quadruplex au sein du génome

Résumé

L’acide désoxyribonucléique se structure chez les êtres vivants de différentes façons. La plus connue est sa forme double hélice mais de nombreuses autres structures secondaires existent et notamment les G-quadruplex. Il s’agit d’une structure basée sur le repliement d’un brin d’ADN possédant des répétitions de guanines. L’association de quatre guanines entre elles par liaisons hydrogène forme un plan appelé G-quartet. Ce réseau de liaisons hydrogène est appelé appariement de Hoogsteen. L’empilement d’au moins deux quartets autour d’un cation monovalent comme le potassium ou le sodium constitue la structure G-quadruplex. Ces structures ont été très étudiées lors des vingt dernières années et il a été montré qu’elles sont impliquées dans de nombreux mécanismes biologiques tels que la réplication, la transcription, la traduction et également le maintien des télomères. La présence des G-quadruplex peut provoquer une instabilité importante aussi bien génétique qu’épigénétique. C’est pourquoi de nombreuses méthodes ont été développées afin de localiser et comprendre le rôle de ces structures in vivo. Pour cela, un large panel d’outils moléculaires a été utilisé cependant il est encore difficile, à partir de ce panel, d’apporter une réponse à toutes les questions sur l’implication des G-quadruplex au niveau du génome. Lors de ce travail de thèse, nous avons alors développés de nouvelles molécules capables de cibler sélectivement les G-quadruplex au sein d’un milieu biologique complexe à partir de deux ligands PDC et PhenDC3 affins et sélectifs pour les structures G-quadruplex.Sur la base de molécules de référence que sont PhenDC3 et PDC, de nombreux ligands ont été mis au point. D’une part, des ligands fonctionnalisés avec une biotine et/ou un groupement photoactivable ont été synthétisés afin de capturer et d’extraire des structures G-quadruplex dans un milieu biologique. D’autre part, des dérivés capables d’être fonctionnalisés in cellulo par l’utilisation de chimie bioorthogonale ont également été obtenus. Ceci permet d’ajouter une fonction (fluorescente ou biotine…) après que le dérivé ait interagi avec sa cible cellulaire. L’ensemble des composés a été évalué par des techniques biophysiques, l’expérience de FRET-melting et l’expérience de FID, afin de mesurer leur affinité pour différentes structures G-quadruplex et leur sélectivité. Nous avons proposé une relation entre les deux expériences afin d’avoir un classement de ligands le plus approprié pour les G-quadruplex.Un des objectifs majeurs de ce travail était de localiser les ligands de G-quadruplex au sein de cellules cancéreuses humaines. Dans un premier temps, toute une étude au sein de cellules fixées a été réalisée en utilisant deux réactions de chimie « click », la réaction de cycloaddition d’un azoture et d’un alcyne catalysée par le cuivre (CuAAC) et la réaction de cycloaddition d’une cyclooctyne et d’un azoture (SPAAC). L’étude s’est, dans un second temps, poursuivie au sein de cellules vivantes en utilisant uniquement la réaction SPAAC à cause de la toxicité in cellulo du cuivre.Ces composés ont également été testés pour l’extraction de G-quadruplex à l’aide de billes magnétiques recouvertes d’une fonction cyclooctyne. Cependant, les résultats observés, lors de cette étude préliminaire, n’ont pas été concluants et demandent une mise au point pour optimiser le système. (Soutenue le 15 décembre 2017)