Séquençage ARN en Single Cell
Le séquençage de l'ARN à cellule unique (« single cell ») permet d'étudier le transcriptome de cellules individuelles. Différentes méthodes complémentaires de séquençage d'ARN single cell existent. La méthode utilisée dépendra de votre question biologique et de votre matériel de départ:
Séquençage d'ARN 3’
Le séquençage d’ARN 3’ permet de quantifier l’expression des gènes et d’identifier des populations cellulaires. Dans le séquençage ARN 3', les ARN messagers poly(A)+ sont reverse transcrits à l'aide d'une amorce polydT. Cette séquence polydT est juxtaposée aux codes-barres nécessaires à l’identification des cellules uniques et au séquençage. Les molécules d'ADNc générées sont amplifiées puis fractionnées. Seules les extrémités 3' des transcrits portant les codes-barres sont représentées dans les banques et seront séquencées. Le 3' scRNA-seq représente une méthode relativement simple de quantification des ARNm poly(A)+ de cellules individuelles.
3' scRNA-seq sur la plateforme NGS
3' scRNA-seq est disponible en routine sur la plate-forme NGS en utilisant le pipeline 10X Genomics. Le matériel d'entrée requis est de 1 000 à 20 000 cellules ou noyaux et le taux de récupération (rendement) est d'environ 50 % des cellules/noyaux chargés. Les recommandations de séquençage sont d'environ 50 000 à 100 000 reads par cellule ou noyau.
Le 3' scRNA-seq peut être combiné à des anticorps spécifiques afin de mesurer l’expression de protéines de la surface cellulaire (CITEseq) ou bien pour augmenter la capacité de multiplexage (Cell Hashing). Les effets de perturbations du transcriptome par CRISPR peuvent également être évalués à la résolution de cellules uniques en combinant la capture directe des sgRNA avec la mesure de l’expression des gènes au sein de chaque cellule.
3' scRNA-seq sur la plateforme Custom Single Cell Omics
La plateforme Custom Single Cell Omics (CSCO) développe actuellement une méthode inDrop 3' scRNA-seq. Dans cette approche, des cellules individuelles d'une suspension cellulaire sont isolées en gouttelettes. Les cellules sont lysées et des codes-barres uniques ajoutés aux ARNm poly(A)+ dans les gouttelettes. Par la suite, les gouttelettes sont regroupées et l'ADNc est préparé pour le séquençage. Cette méthode "à façon" permet de séquencer un grand nombre de cellules à faible coût et de s'adapter à des questions spécifiques. Plus d’informations à venir.
Séquençage single cell d'ARN complets
Contrairement au séquençage d'ARNc 3' ou 5', le séquençage d'ARN complets couvre l'intégralité de la séquence des molécules d'ARN, permettant par exemple la résolution des allèles, ainsi que l'identification des isoformes d'épissage et des variantes génétiques.
Séquençage single cell d'ARN pleine longueur sur la plateforme Custom Single Cell Omics
La technologie de séquençage single cell d'ARN entiers « Smart-seq3 » est disponible sur la plateforme Custom Single Cell Omics. Le Smart-seq3 quantifie des milliers de molécules d'ARN par cellule, affichant une sensibilité nettement supérieure par rapport au Smart-seq2 précédent. Pour plus d'informations, voir Hagemann-Jensen et al, 2020 (DOI 10.1038/s41587-020-0497-0).
Le matériel de départ doit compter au moins 500 cellules par échantillon, et environ 384 cellules peuvent actuellement être séquencées.
Séquençage single cell d'ARN pleine longueur sur la plateforme NGS
Le développement d’une approche combinant les techniques de transcriptomique en cellule unique 10X Genomics et de séquençage Long Read PacBio est en cours à la plateforme NGS. Les cDNA générés par la technologie 3' scRNA-seq seront utilisés, en complément de l’approche classique, pour préparer des banques compatibles avec le séquenceur Sequel II de Pacific Biosciences. Cette technologie unique disponible à la plateforme NGS génère des reads couvrant la totalité des transcrits (de l’extrémité 5’ à 3’) permettant ainsi d’étudier les isoformes de manière précise, sans besoin d’assemblage.
5' scRNA-seq+ VDJ
Le séquençage d’ARN 5’ permet de quantifier l’expression des gènes et d’analyser le répertoire immune. Dans le séquençage d'ARN 5', les ARNm poly (A) + sont reverse transcrits à l'aide d'une amorce polydT. Cependant, et contrairement au séquençage d'ARNc 3', les codes-barres de séquençage ne sont pas adjacents à l'amorce polydT, mais ils sont situés à l'extrémité 5' des transcrits. L'avantage et l'utilisation majeur du 5′ est de combiner le profilage de l'expression génique avec l'identification de la totalité des fragment V(D)J (chaînes a et b du TCR, chaîne lourde et légère des Igs et BCR dans les cellules B) dans les mêmes cellules.
5' scRNA-seq sur la plateforme NGS
Le 5' scRNA-seq est disponible en routine sur la plate-forme NGS en utilisant le pipeline 10X Genomics. Le matériel d'entrée requis est de 1 000 à 20 000 cellules ou noyaux et le taux de récupération (rendement) est d'environ 50 % des cellules/noyaux chargés. Les recommandations de séquençage sont d'environ 50 000 à 100 000 reads par cellule ou noyau.
Le 5' scRNA-seq peut être combiné avec des anticorps spécifiques afin de mesurer l’expression de protéines de la surface cellulaire à l'aide (CITEseq) ou bien pour augmenter la capacité de multiplexage (Cell Hashing).
