Sondes fluorescentes pour le marquage d’ADN
- Marie-Paule Teulade-Fichou
- Florence Mahuteau-Betzer
- Delphine Martin
La conception de sondes fluorescentes pour la détection d’acides nucléiques est un domaine très étudié depuis une dizaine d’années. Les caractéristiques requises pour de telles sondes sont une meilleure affinité et une meilleure sélectivité pour l’ADN que pour les autres composants cellulaires, une exaltation importante de fluorescence lors de la formation du complexe sonde-ADN, une faible mutagénécité et une émission dans la fenêtre spectrale physiologique (700-130 nm) pour laquelle les tissus biologiques absorbent le moins.
Dans ce contexte, nous avons développé des systèmes conjugués à transfert de charges important basés sur un cœur triphénylamine (TP). La première génération de vinyltriphénylamines possédait un pyridinium comme accepteur et répondait aux arrangements quadrupolaires (2 branches) et octupolaires (3 branches).
Ces sondes sont des sondes on-off d’ADN avec une émission dans le rouge, une bonne affinité pour l’ADN et de bonnes propriétés d’absorption biphotonique. L’optimisation de ces sondes a conduit à l’identification de la série TP-Bzim portant des accepteurs benzimidazoliums. Les TP-Bzim montrent une amélioration notable de leur affinité pour l’ADN et de leurs propriétés photophysiques spécialement pour la deux-branches qui montrent une exaltation de 140 (TP-2Bzim: ΦF = 0.54, Ka = 107 M−1). Enfin, la section efficace d’absorption pour la TP-2Bzim est largement augmentée lorsque la sonde est liée à l’ADN (δ = 1080 vs 110 GM pour la forme libre). Cet effet de la matrice ADN sur les propriétés d’optique non linéaire est mis à jour pour la première fois.
Ces propriétés permettent d’imager l’ADN nucléaire dans des cellules fixées à des concentrations sub-micromolaires. Enfin, la sonde TP-2Bzim possède une grande photostabilité, pénètre en cellules vivantes et ne requiert pas de traitement à la RNAse. La combinaison des propriétés optique et biologique rend ce marqueur extrêmement efficace pour le marquage d’ADN.
Par contre, en cellules vivantes, ce marqueur s’accumule majoritairement dans les mitochondries et déclenche l’apoptose lorsqu’il est soumis à une irradiation prolongée. Ce processus est accompagné d’une relocalisation subcellulaire vers le noyau, ce qui permet de suivre par fluorescence l’apoptose.
Enfin, nous avons cherché à développer des marqueurs de protéines autour du cœur vinyltriphénylamine. Nous avons d’abord étudié l’affinité de ces sondes pour une protéine modèle (l’albumine sérique humaine) en spectroscopie de fluorescence. En remplaçant l’accepteur cationique par un accepteur anionique, nous avons modifié la cible de nos marqueurs (en passant de l’ADN à la HSA) sans affecter les propriétés optiques à savoir le caractère on-off, l’absorption biphotonique…
Des conjugués de ces différentes sondes optiques sont en cours de développement.
